筑起機體免疫長城

【用途】 用于山羊痘病毒核酸的檢測。
【試劑】

編號	20T	50T	保存
裂解液	4mL	10mL	室溫	A盒
無水乙醇	4mL	10mL	室溫
去蛋白漂洗液	12mL	28mL	室溫
洗滌液	32mL	77mL	室溫
洗脫液	2mL	5mL	室溫
蛋白酶K	0.2mL	0.5mL	-20℃	B盒
PCR反應液	200μL	500μL	-20℃
引物和探針	40μL	100μL	-20℃
陽性對照	30μL	30μL	-20℃
滅菌水	300μL	300μL	-20℃

【操作步驟】
1.樣本前處理及核酸提取  
樣本前處理：
取適量皮膚丘疹、肺部病變組織、淋巴結，于滅菌研缽充分研磨，用PBS按照1：3體積稀釋成均勻乳劑，經10 000rpm離心3 min。
核酸提?。?br /> (1)取200μL上述樣本離心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL離心管,然后加入200μL裂解液，劇烈振蕩。(蛋白酶K開蓋使用后建議存于2-8℃)混勻5～10秒。
(2)56℃溫浴10分鐘。
(3)在上述離心管中加入200μL無水乙醇，充分振蕩混勻5～10秒。
(4)將步驟3中混勻的液體轉移至一只套有收集管的純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，棄去套管內液體。
(5)將500μL去蛋白漂洗液加入純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，并棄去套管內液體。
(6)將700μL洗滌液加入純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，并棄去套管內液體。
(7)可選：重復步驟（6）。
(8)再將純化柱放回接液管上，13 000rpm離心1分鐘。
(9)將純化柱移到一只干凈的1.5mL離心管中。
(10)向離心柱內加50μL洗脫液，室溫靜置1分鐘后12 000rpm離心1分鐘，棄純化柱，離心管內液體中含有基因組DNA。提純的基因組DNA如果不立即使用，請保存于-20℃。
2. 熒光PCR加樣體系（總體系20 μL）：將下列試劑加入PCR反應管中。

PCR反應液 引物和探針	10μL 2μL
模   板 滅菌水	2μL 6μL

（注：陰、陽性對照設立，由試劑盒提供的陽性對照、滅菌水直接替換“模板”即可。）
 
3. 反應程序
在熒光PCR儀上進行以下反應：95 ℃ 180s，循環95 ℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，共45次, 每次循環的第三步（72℃ 20 s）收集熒光信號（報告基團“HEX”，淬滅基團“BHQ1”）。
【結果判定】
1 閾值設定
檢測結束后，根據收集的熒光曲線和 Ct值直接讀取檢測結果，Ct值為每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。 
2 質控標準
(1) 陰性對照：無Ct值無擴增曲線。
(2) 陽性對照：Ct值≤30.0，并出現典型的擴增曲線。若陰、陽性對照組結果不成立，則視為無效檢驗。
3 結果描述及判定
陰性  被檢樣品無Ct值且無明顯擴增曲線，判為山羊痘病毒核酸陰性；
陽性  檢測樣品Ct值≤42.0且出現典型的擴增曲線時，判為山羊痘病毒核酸陽性；
可疑  對于Ct值＞42.0的樣品且出現典型的擴增曲線或者Ct值≤42.0但無典型的擴增曲線時，應重檢，重檢Ct值≤42.0且出現典型的擴增曲線時判為陽性，其他情況均判為陰性。
【注意事項】
1.B盒使用之前請完全溶解并離心數秒后使用，蛋白酶K開蓋使用后建議保存于2-8℃。
2 反復凍融試劑將降低檢測靈敏度，盡量減少反復凍融。
3 為避免樣本間的交叉污染，模板最后加，加模板時先加陰性對照，再加檢測樣品，最后加陽性對照，有條件的實驗室加模板的移液器應與加其它組份的移液器分開。
4 上機前注意檢查確保反應混合液內無氣泡，且反應管蓋緊，以免熒光物質泄漏區污染儀器。
【生產企業】   
企業名稱：山東綠都生物科技有限公司
生產地址：山東省濱州市經濟開發區黃河二路169號綠都生物工程高科技園
電    話：0543-3403060       傳    真：0543-3403060
【有效期】本制品有效期為1年，生產日期見包裝內側。
 
僅供獸醫診斷使用