??谔阋逜型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒使用說明書

     更新時間:2019-06-19       瀏覽量:
【產品名稱】
通用名稱:??谔阋逜型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒
英文名稱:Liquid-phase Blocking ELISA Kit for Detecting FMDV Type A Antibodies
【規格】96T×2塊
【用途】
檢測牛血清中的口蹄疫A型抗體,適用于動物疫苗免疫抗體監測。
【儲藏與有效期】2~8℃保存,有效期12個月。
【主要組份】 
序號 組份名稱 數量
1 FMDV-A抗原包被板 96T×2塊
2 HRP-A型FMD單抗 12mL×1瓶
3 樣品稀釋液 20mL×1瓶
4 FMDV-A陰性對照 1.0mL×1管
5 FMDV-A陽性對照 1.0mL×1管
6 單組份TMB 12mL×1瓶
7 終止液 12mL×1瓶
8 濃縮洗滌液(20×) 20mL×1瓶
9 說明書 1份
 
【試驗操作】
1、洗滌液配制 
將濃縮洗滌液(20×)用蒸餾水或去離子水稀釋成洗滌液(1×),即1份濃縮洗滌液加入19份蒸餾水,配制的洗滌液(1×)作為洗板用。
 
2、定性檢測方案(單孔定性,每板檢測92份血清樣本)
 
【操作步驟】
2.1加樣:設陰性對照血清(A1B1)和陽性血清(C1D1)各2孔,直接加入50ul/孔對照血清;其它為被檢樣品孔,預先在相應孔內加入45ul的稀釋液,接著加入5ul/孔待檢血清;最后,在所有孔內均加入50ul的HRP-O型FMD單抗,被檢血清即為1:20稀釋。振蕩,混勻,37℃溫育30分鐘。
2.2TMB底物:用洗滌液洗板3遍,最后一次拍干,加入TMB底物,50ul/孔,37℃溫育15分鐘。
2.3反應終止: 加入終止液,50ul/孔,終止反應。
2.4讀值:酶標儀450nm波長讀數。
 
【計算方法】
2.5阻斷率計算
陰性對照平均值=(OD-A1+OD-B1)/2;
陽性對照平均值=(OD+C1+OD+D1)/2;
樣品阻斷率 PI=[(陰性對照平均值-樣品OD值)/陰性對照平均值]×100%
根據以上公式計算被檢樣品和陽性對照樣品的阻斷率。
   2.6試驗成立
    兩孔陰性對照OD450nm值至少一孔OD值大于0.5;兩孔陽性對照至少一孔的阻斷率大于60%。
【結果判定】
被檢樣品PI≥50%判為口蹄疫病毒A型抗體陽性;PI<50%判為口蹄疫病毒A型抗體陰性。
 
3、檢測方案(每板檢測10或20份血清樣本)
 
在使用前,所有的試劑盒組份應恢復到室溫。試劑應輕輕旋轉或振蕩混勻。每個樣品使用一個單獨的吸頭。
3.1樣品稀釋: 取出FMD-O抗原包被板,根據不同的需要,選擇圖1或圖2中的一種布局進行操作。圖1為可檢測10份樣品布局圖;圖2為可檢測20份樣品布局圖。每次試驗,每板均需設置陰陽性血清對照及4孔不加血清單抗對照。
以圖1為例操作,A1~A10每孔各加75µL的稀釋液,其它所有孔內各加入50µL的稀釋液。A1~A10每孔各加25µL的待檢樣品,A11孔加50µL的陽性對照,A12孔加50µL的陰性對照,用排槍吹打混勻(每孔吹打3~5次),待檢樣品A1~A10分別以50µL/孔的量從A到H連續2倍稀釋;陽性對照A11以50µL/孔的量從A到H連續2倍稀釋;陰性對照A12以50µL/孔的量從A到B連續2倍稀釋。待檢樣品在第1~10列從1:4稀釋至1:512;陽性對照,從1:2稀釋至1:256,由于試劑盒提供的陽性對照已1:4稀釋,則變為從1:8稀釋至1:1024;陰性對照,從1:2稀釋至1:4。
3.2 加入HRP-A型FMD單抗:樣品稀釋好后,在所有孔內加入50ul的HRP-A型FMD單抗,反應體系即為100µL/孔。加樣完畢后,所有稀釋度翻倍,待檢樣品從1:8~1:1024,陽性對照從1:16~1:2048,陰性對照從1:4~1:8,貼封板膜,振蕩混勻。將加好樣的ELISA反應板置于37℃溫育30分鐘。
3.3洗板:用230μL(±20μL)洗滌液(1×)洗滌板孔,共洗滌3次。每次洗滌后應棄去孔內的液體。在最后一次洗滌液棄去后,將孔中殘留的洗滌液拍干。按50μL/孔加入TMB底物,37℃避光溫育10~15min。
3.4讀值: 每孔再加50μL終止液終止反應,立即在450nm波長下讀取OD值。
 
圖1  96孔板檢測10份樣品布局圖 
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 1:8 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1:16 1:4
B 1:16                   1:32 1:8
C 1:32                   1:64 空白
D 1:64                   1:128 空白
E 1:128                   1:256  
不加血清單抗
對照
F 1:256                   1:512
G 1:512                   1:1024
H 1:1024                   1:2048
 
圖2  96孔板檢測20份樣品布局圖 
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 1:16 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 1:16 1:4
B 1:32                   1:32 1:8
C 1:64                   1:64 空白
D 1:128                   1:128 空白
E S11 1:16 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 1:256  
不加血清單抗
對照
F 1:32                   1:512
G 1:64                   1:1024
H 1:128                   1:2048
 
 
【結果分析】
3.5試驗成立判斷
不加血清單抗對照OD值應在2.0±1.2范圍內;
陽性對照抗體效價不低于1:1024±1滴度;
陰性對照抗體效價應<1:8。
3.6結果判定
不加血清單抗對照4孔,棄去最高和最低OD值,計算剩余2孔的平均OD值,再除以2,即得50%對照值,該值即為臨界值,表示阻斷50%反應的對照OD值。待檢樣品OD值>臨界值,判為陰性孔;待檢樣品OD值≤臨界值,判為陽性孔。每份待檢樣品系列梯度稀釋中,陽性孔的最高稀釋倍數即為該待檢樣品的抗體效價。若臨界值處于兩個稀釋孔OD值之間,抗體效價取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數的反對數中間值。如臨界值處于1:64(反對數值為1.8)與1:128(反對數值為2.1)之間,則判定該份待檢樣品的抗體效價為1:90(反對數值為1.95)。
抗體效價≥64,為疫苗免疫合格。
抗體效價計算對照表(反對數值)
抗體效價 Log10(效價)
對照計算
抗體效價 Log10(效價)
對照計算
抗體效價 Log10(效價)
對照計算
1:4 0.6 1:32 1.5 1:256 2.4
1:6 0.75 1:45 1.65 1:360 2.55
1:8 0.9 1:64 1.8 1:512 2.7
1:11 1.05 1:90 1.95 1:720 2.85
1:16 1.2 1:128 2.1 1:1024 3
1:22 1.35 1:180 2.25 1:1440 3.15
 
 
4、注意事項
4.1 為使您的實驗獲得正確結果,請您在實驗前仔細閱讀本說明書。
4.2 所有試劑使用前恢復至室溫(18~26℃),以免溫度過低影響抗原抗體反應。
4.3實驗前應用溫度計檢查溫箱溫度,溫度過高或過低影響OD值高低。
4.4 包被板反應時嚴禁堆疊放置,應該平鋪且板間有空隙,不要離溫箱壁太近。
4.5實驗所用移液器及設備應定期校準。
4.6采集的樣品要新鮮,并且最好不要溶血。血清標本在2~8℃放置不要超過2天,室溫不超過8小時,如需長時間放置應儲存于-20℃。
【聯系人】 王金良                                                   電話:0543-3403060
僅供獸醫診斷使用           



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編輯:熊方方




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